PRIN 2010-Dieta omnivora...

Il progetto parte dall'idea generale che differenti abitudini alimentari possano rappresentare per l'uomo una fonte di differenti quantità e tipologie sia si nutrienti sia di
microbe. Da tale presupposto, è stato ipotizzato che numerosi differenti fattori determinano l'impatto di una data dieta sulla microflora umana e che tale impatto
coinvolga una molteplicità di differenti eventi. In base a tali premesse, la nostra Unità di Ricerca (RU7) focalizzerà le proprie attività di ricerca sullo studio di due
aspetti rilevanti per la comprensione dell'intero quadro:
1) studio della diversità delle comunità batteriche degli aliemnti rappresentatitivi della dieta omnivora, vegetariana e vegana;
2) studio dell'impatto della dieta omnivora, vegetariana e vegana sulla distribuzione di batteri lattici con antibiotico-resistenze trasmissibili nella cavità orale e
nell'intestino di individui omnivori, vegetariani e vegani.
Il primo aspetto sarà investigato determinando la composizione delle comunità batteriche di alimenti caratteristici della dieta omnivore, vegetariana e vegana,
selezionati sulla base: i) delle informazioni raccolte dalla RU4 sulle abitudini alimentari dei volontari omnivori, vegetariani e vegani arruolati nel progetto e riportate
nei diari alimentary; e (ii) delle cariche microbiche determinate dalla RU4 e 5 utilizzando analisi convenzionali coltura-dipendenti. La diversità batterica degli alimenti
in studio sarà preliminarmente valutata via PCR-DGGE, utilizzando un set di primer specifici per l'amplificazione della regione V3 del gene codificante il 16S rRNA.
Gli aliementi saranno quindi clusterizzati dalla RU2 sulla base dei profili DGGE ottenuti. Il DNA batterico totale estratto dagli alimenti selezionati in base ai risultati
dell'analisi cluster sarà inviato alla RU3 per lo studio approfondito della diversità microbica attarverso l'ultilizzo di tecniche di sequenziamento di nuova generazione.
Successivamente, la nostra RU studierà l'impatto della dieta omnivora, vegana e vegetariana sul rischio di introdurre geni di antibiotico-resistenza (AR). A tale scopo,
i campioni di saliva e feci raccolti dai volontari arruolati nel progetto dale RU 1, 4, 6 e 8 saranno screenati per la presenza di geni responsabili di resistenza a
tetracicline [tet(M), tet(K), e tet(O)], macrolidi-limcosamide-streptogramina [erm(A), erm(B) e erm(C)] e vancomicina [van(A) e van(B)], utilizzando protocolli
otimizzati di PCR già disponibili presso i nostri laboratori.
I campioni positivi per almeno uno dei geni in studio saranno inoculati in mezzi colturali selettivi addizionati di concentrazioni di tetraciclina, eritromicina o
vancomicina scelte in base ai più aggiornati breakpoints definti da istituti internazionali per l'isolamento di lattobacilli, lattococchi ed enterococchi
antibiotico-resistenti. Un numero rappresentativo di colture isolate con tecniche microbiologiche convenzionali saranno sottoposte ad identificazione molecolare
mediante sequenziamento del gene codificante il 16S rRNA e a determinazione della Minima Concentrazione Inibente (MIC). Gli isolati con valori di MIC più elevati
dei corrispondenti breakpoints per uno (o più) antibiotici saranno sottoposti ad amplificazione. I prodotti di amplificazione dei geni di AR ottenuti da un pool di isolati
saranno sottoposti a sequenziamento per verificare la specificità dell'amplificazione. Lo stesso pool di isolati saranno sottoposti ad analisi molecolari finalizzate a
determinare la localizzazione dei geni di AR. Infine, la possibilità di trasferimento dei geni di AR localizzati su elementi genetici mobili dai nostril isolati a batteri di
interesse clinico sarà valutata attraverso saggi di filter mating